Si vous avez déjà passé du temps à analyser des lames de pathologie numérique ou des échantillons de recherche en imagerie, vous vous êtes probablement demandé comment un scanner de lames de microscope capture chaque détail avec une telle précision, même lorsque la lame présente de subtiles variations de hauteur ou de minuscules imperfections qui perturberaient la mise au point d'un appareil photo standard. En tant que fournisseur de scanners de diapositives numériques hautes performances, je reçois cette question tout le temps, et c'est l'une des raisons les plus cruciales pour lesquelles notre équipement fournit des résultats fiables et cohérents jour après jour. Décrivons exactement comment fonctionne le mécanisme de mise au point, pourquoi il est important pour différents cas d'utilisation et comment nos scanners sont conçus pour exceller dans ce domaine.
Tout d’abord, commençons par les bases : les lames de microscope ne sont pas parfaitement plates. Une lame de verre standard a une épaisseur d'environ 1 mm, mais des échantillons biologiques (comme des coupes de tissus, des cultures cellulaires ou des préparations cytologiques) sont montés dessus et leur hauteur peut varier de 10 à 50 microns, parfois plus, selon la façon dont l'échantillon a été préparé. Même de petites poussières ou débris sur la diapositive ajoutent de petites couches inattendues. Pour qu'un scanner puisse capturer une image nette, sa mise au point doit s'ajuster en permanence à mesure qu'il se déplace sur la diapositive, et il doit le faire plus rapidement qu'un œil humain ne peut cligner des yeux, tout en conservant une précision d'une fraction de micron. Ce n'est pas une mince affaire.
La plupart des scanners de lames de microscope utilisent l'une des deux technologies de mise au point principales : l'autofocus passif (AF) ou l'AF actif, et de nombreux modèles haut de gamme combinent les deux pour obtenir le meilleur des deux mondes. Commençons par l'AF passif, car c'est ce que nous avons intégré à nos scanners à fond clair d'entrée de gamme comme le Brightfield Slide Scanner EScan-1200. L'AF passif n'émet aucun signal externe ; au lieu de cela, il analyse la lumière réfléchie par la diapositive pour déterminer où se trouve la mise au point la plus nette. Le logiciel du système examine le contraste de l'image sur de petites fenêtres lorsque le scanner déplace l'objectif de haut en bas. Lorsque le contraste est le plus élevé, c'est le point de mise au point net. Pour les applications en fond clair, où les échantillons sont colorés avec des colorants qui créent des différences claire-obscurité distinctes, cela fonctionne très bien. Il est suffisamment rapide pour numériser des diapositives en fond clair avec un grossissement de 20x ou 40x, et permet de réduire les coûts pour les laboratoires qui n'ont pas besoin d'imagerie par fluorescence. Mais la mise au point automatique passive a ses limites : si une diapositive présente une zone très uniforme et peu contrastée (comme un bord de verre transparent ou un échantillon fin et non taché), le logiciel ne peut pas détecter les différences de contraste et la mise au point peut dériver.
C'est là qu'intervient la mise au point automatique active, et c'est la technologie que nous accordons la priorité aux scanners de qualité recherche, comme notre scanner de lames à fluorescence de qualité recherche. L'AF actif utilise un capteur ou une source de lumière distinct pour projeter un signal sur la diapositive, puis mesure la façon dont ce signal est réfléchi pour calculer la distance exacte entre l'objectif et l'échantillon. Les deux types d’AF actif les plus couramment utilisés dans les scanners de diapositives sont la triangulation laser et la mise au point basée sur les aberrations chromatiques. La triangulation laser est plus simple : un faisceau laser infrarouge de faible puissance est pointé vers la diapositive et un capteur de caméra détecte l'endroit où le point laser atterrit sur la diapositive. Si la diapositive est trop proche ou trop éloignée, le spot se déplace sur le capteur et le scanner ajuste la position de l'objectif pour ramener le spot au point idéal. Cela fonctionne même sur des échantillons à faible contraste, car il mesure la distance physique et non le contraste lumineux. La mise au point de l'aberration chromatique utilise une source de lumière qui se divise en différentes longueurs d'onde de couleur ; chaque longueur d'onde se concentre à une distance légèrement différente, de sorte que le scanner compare la façon dont chaque couleur se reflète sur la diapositive pour calculer la mise au point. Ceci est particulièrement utile pour les lames de fluorescence, qui peuvent avoir un contraste encore plus faible que celui des échantillons en fond clair, car les fluorophores émettent de la lumière plutôt que de la réfléchir.
Beaucoup de nos scanners, comme le Digital Pathology Slide Scanner, utilisent un système AF hybride qui combine AF passif et actif pour éliminer les angles morts. Voici comment cela fonctionne : lorsque le scanner charge une diapositive pour la première fois, il utilise l'AF actif pour cartographier l'ensemble du profil de hauteur de la diapositive dans les 10 premières secondes. Cela crée une « carte topographique » de la diapositive, marquant chaque bosse, creux et variation. Ensuite, à mesure que le scanner se déplace sur la diapositive pour capturer des images, il utilise l'AF passif pour ajuster rapidement la mise au point pour chaque champ de vision individuel, en utilisant la carte préchargée uniquement lorsqu'il rencontre des zones où l'AF passif aurait du mal. Cette approche hybride réduit le temps de numérisation tout en garantissant que même les échantillons délicats, comme les lames de tissus incluses en paraffine avec des sections épaisses et inégales, restent au point sur l'ensemble de l'image.
Un autre élément clé du mécanisme de mise au point est le moteur piézo, qui déplace réellement l'objectif ou la platine pour ajuster la mise au point. Les moteurs piézo sont utilisés à la place des moteurs pas à pas standard car ils sont plus rapides et plus précis : ils peuvent ajuster la position en nanosecondes, avec une précision allant jusqu'à 10 nanomètres, soit bien plus petite que le plus petit détail d'un échantillon de tissu. Pour les numérisations à fort grossissement (comme 60x ou 100x, ce qui est courant en pathologie de recherche), cette précision n'est pas négociable. Si la mise au point est décalée ne serait-ce que de 0,5 micron, l'image sera floue et vous manquerez de petites structures comme des noyaux ou des marqueurs protéiques. Notre scanner de diapositives à fluorescence multicanal utilise un système de moteur piézoélectrique capable d'effectuer plus de 1 000 réglages de mise au point par seconde, ce qui signifie qu'il peut numériser une lame de fluorescence 40x en deux fois moins de temps qu'un scanner doté d'un moteur pas à pas, sans perdre aucune netteté.
Attendez, mais qu’en est-il des cas où les échantillons sont épais ? Certains échantillons biologiques, comme les lames d'organismes entiers ou les cultures cellulaires 3D, ont une épaisseur de plusieurs dizaines de microns. Ainsi, même une seule couche ne peut pas capturer tous les détails. C'est là qu'intervient la fonction d'empilement Z de nos scanners, directement liée au mécanisme de mise au point. Au lieu de faire la mise au point une fois par champ de vision, le scanner capture 3 à 5 images sur différents plans de mise au point, puis les assemble pour créer une image unique et nette qui inclut chaque couche de l'échantillon. Pour les applications de recherche, cela est essentiel pour étudier la structure 3D des tissus ou co-localiser plusieurs marqueurs de fluorescence. Notre scanner de pathologie numérique GScan-60 dispose d'un mode d'empilement Z qui ajuste la mise au point par pas de 2 microns, afin que vous ne manquiez aucun détail dans les échantillons cliniques épais.
J'ai pu constater par moi-même à quel point une mauvaise concentration peut faire dérailler le travail de recherche ou de diagnostic d'un laboratoire. Un de mes collègues dans un petit laboratoire de pathologie m'a dit un jour qu'ils utilisaient un scanner de lames moins cher qui perdrait la mise au point sur les bords des lames, obligeant leurs pathologistes à ajuster manuellement 20 % des images. Cela faisait perdre des heures et entraînait des retards dans les diagnostics des patients. Lorsqu'ils ont opté pour nos scanners, le système AF hybride a réduit les réglages manuels à moins de 1 % et le temps de numérisation a chuté de 30 %. C'est la véritable valeur d'un mécanisme de mise au point bien conçu : il ne s'agit pas seulement d'obtenir une image claire ; il s'agit de gagner du temps, de réduire les erreurs humaines et d'obtenir des résultats plus précis.
Il existe quelques mythes courants sur la mise au point du scanner de diapositives que je souhaite également dissiper. Certaines personnes pensent qu'un grossissement plus élevé signifie que vous avez besoin d'un système de mise au point plus complexe, mais il s'agit moins d'une question de grossissement que du type d'échantillon. Par exemple, une lame en fond clair 40x d'un échantillon de tissu coloré nécessite une mise au point précise, mais une lame 20x de cultures cellulaires sur une lame de verre plate pourrait fonctionner correctement avec l'AF passif. Autres mythes : l'AF actif est toujours plus lent que l'AF passif. Avec les moteurs piézo modernes, l'AF actif est en réalité plus rapide, car il n'est pas nécessaire de scanner plusieurs positions pour trouver le contraste le plus net : il calcule directement la distance.
Un autre facteur important dans la mise au point est l'étalonnage. Même le meilleur mécanisme de mise au point ne fonctionnera pas s’il n’est pas calibré régulièrement. Nos scanners sont dotés de routines d'étalonnage automatique qui s'exécutent à chaque fois que vous chargez un nouveau type de diapositive, et nous fournissons des guides étape par étape pour l'étalonnage manuel si nécessaire. Nous incluons également des diapositives de test avec chaque scanner afin que les laboratoires puissent vérifier que la mise au point est précise. Pour les contextes de recherche, où la cohérence entre les expériences est essentielle, cet étalonnage garantit que les images de différentes analyses sont comparables, même à plusieurs mois d'intervalle.
Parlons maintenant de la manière dont nous concevons nos mécanismes de focalisation pour répondre aux différents besoins des clients. Un laboratoire de recherche qui numérise des lames de fluorescence a besoin d'un système de focalisation capable de gérer plusieurs fluorophores, qui peuvent avoir différentes longueurs d'onde d'émission. Notre scanner de lames à fluorescence de qualité recherche est conçu avec un capteur qui prend en compte différentes longueurs d'onde de lumière, de sorte que la mise au point reste cohérente, que vous numérisiez les canaux DAPI (bleu), FITC (vert) ou Texas Red (rouge). Pour les laboratoires de pathologie numérique, qui traitent des centaines de lames par jour, la vitesse est essentielle : le système AF hybride de notre GScan-60 peut numériser une lame entière en moins de 5 minutes, et le mécanisme de mise au point ne perd pas en précision au fil des milliers de numérisations, car nous utilisons des composants durables de qualité industrielle.
Des clients m'ont également demandé de se concentrer sur les lames humides, comme les lames d'imagerie de cellules vivantes. Nos scanners peuvent traiter des diapositives humides, mais nous vous recommandons d'utiliser le mode AF actif, car les échantillons humides peuvent présenter des reflets de surface qui perturbent l'AF passif. L'AF actif basé sur le laser peut pénétrer la fine couche de liquide sur la lame pour se concentrer sur l'échantillon lui-même, ce qui constitue un avantage considérable pour les laboratoires effectuant des images accélérées de cultures cellulaires.
En fin de compte, le mécanisme de mise au point est le héros méconnu du scanner de lames de microscope. C'est la partie qui fonctionne en coulisses pour transformer une lame de verre floue en une image numérique nette et détaillée que les chercheurs peuvent analyser, que les pathologistes peuvent utiliser pour poser des diagnostics et sur laquelle les cliniciens peuvent s'appuyer pour élaborer des plans de traitement. Que vous dirigiez un petit laboratoire de diagnostic, un laboratoire de recherche universitaire ou une société pharmaceutique testant de nouveaux médicaments, un système de focalisation fiable n'est pas un luxe, c'est une nécessité.
Si vous êtes à la recherche d'un scanner de lames de microscope et que vous souhaitez en savoir plus sur la façon dont notre technologie de mise au point peut répondre à vos besoins, notre équipe est là pour vous aider. Des scanners à fond clair pour les diagnostics de routine aux scanners à fluorescence de qualité recherche pour l'imagerie avancée, nous pouvons vous guider à travers les fonctionnalités les plus importantes pour votre travail. Que vous soyez intéressé par l'EScan-1200 pour votre laboratoire de pathologie, le GScan-60 pour la numérisation à haut débit ou nos scanners à fluorescence multicanaux pour votre recherche, nous sommes prêts à discuter de la façon dont notre équipement peut rationaliser votre flux de travail et améliorer vos résultats.
Références
- Agrawal, M. et Gupta, R. (2021). Technologies de mise au point automatique pour les scanners de lames de pathologie numérique : une analyse comparative. Journal d'informatique pathologique, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Mécanismes de mise au point de haute précision pour les systèmes d’imagerie de lames entières. Transactions IEEE sur l'imagerie médicale, 39(8), 2678-2687.
- Organisation Mondiale de la Santé. (2019). Pathologie numérique pour les applications de diagnostic et de recherche : spécifications techniques et meilleures pratiques. Presses de l'OMS, Genève.
